摘要
水凝胶具有良好的生物相容性以及与天然生物组织相似的力学性能,已广泛应用于生物医学领域。随着生物力学的发展,越来越多的研究发现,基于动态共价键构筑的黏弹性可调复合水凝胶,其优越的生物力学特性和刺激响应性,能更好模拟生物组织和天然细胞外基质随时间变化的黏弹性力学特性。本文详细总结基于不同类型的动态共价键(亚胺键、二硫键、硼酸酯键等)所构筑的黏弹性可调复合水凝胶在调控细胞功能、影响组织再生修复以及药物递送等领域的应用,并提出未来研究所面临的挑战与机遇。
关键词:
复合水凝胶
动态共价键
黏弹性
应力松弛
细胞外基质
水凝胶因其高含水量、良好的生物相容性以及三维聚合物网络结构,已成为一种前景广阔的生物材料,并在组织工程和药物输送等众多领域都得到了广泛的应用 。在水凝胶的设计中,往往选取具有不同结构和功能的高分子材料,通过物理或化学交联作用实现水凝胶的制备。但传统的基于共价化学键交联的水凝胶通常存在结构可调节性差的问题,且其力学性能不能很好地满足脑组织、肌肉和肝脏等软组织的仿生设计需求 。针对这一问题,目前已基于不同的交联策略开发出了黏弹性水凝胶,实现了对水凝胶交联密度、网络结构以及理化性质的调控,可有效模拟天然生物组织复杂的动态力学特性 。
常见的构建黏弹性水凝胶的交联策略包括:① 非共价键,例如氢键、疏水相互作用、金属配体配位以及主-客体相互作用等;② 动态共价键,例如亚胺键、硼酸酯键、二硫键和Diels-Alder键等 。分别改变聚合物浓度或调节动态共价键的动力学,均可赋予基于非共价键或动态共价键的水凝胶可调的黏弹性,但由疏水相互作用等非共价键构建的黏弹性水凝胶往往表现出较弱的力学性能,无法满足细胞生长以及组织重建等对稳定的力学性能的应用需求 。而在水凝胶的三维网络中引入二硫键等动态共价键,不仅增强了水凝胶的力学性能,还可为其提供许多功能优势。相比于金属配体配位等交联方式,大多数基于动态共价键的化学交联反应条件较温和,无毒性副产物,生物相容性良好 。此外,与氢键基水凝胶相比,基于动态共价键的复合水凝胶在pH以及糖浓度等各种刺激下,聚合物的网络结构发生解离与重构,从而可作为药物递送载体实现对药物的可控释放 [9-10] 。更为重要的是,不同类型的动态共价键通常表现出不同的动力学特性,综合利用多种动态共价键,可开发具有不同黏弹性的水凝胶系统 ,并作为工具探究力学信号影响细胞命运的力学生物学机制,为组织工程支架及体外组织模型的研究奠定基础 。
本文详细总结基于4种不同类型的动态共价键(亚胺键、硼酸酯键、二硫键和Diels-Alder键)所构筑的复合水凝胶及其力学特性,进一步介绍基于动态共价键所构筑的黏弹性可调复合水凝胶在模拟细胞外基质(extracellular matrix,ECM)调控细胞行为和功能、组织工程以及药物递送中的应用,并总结了各水凝胶的构建策略、力学性能与应用场景,提出黏弹性可调复合水凝胶所面临的挑战与机遇。
1 基于不同类型动态共价键构筑的黏弹性可调复合水凝胶
水凝胶是一类具有高含水率的三维网络高分子材料,通过不同的交联策略形成的水凝胶通常表现出动态和静态两种特性 。通过传统的共价化学交联制备的水凝胶往往结构简单,具有稳定的物理和化学性质,但不能满足生物医学等领域应用中的更高要求。而基于动态共价键(如亚胺键、硼酸酯键、二硫键和Diels-Alder键等)所构筑的复合水凝胶不仅具有良好的稳定性 ,而且在外界刺激(光、温度和pH等)下可发生键的解离与重组,从而实现聚合物网络结构的动态调整,赋予水凝胶可调的黏弹性。
亚胺键是由亲电试剂(R-CHO-R)与亲核试剂(R-NH 2 )相互反应形成的一种动态共价键 ,根据亲核试剂的不同,可以将其具体分为腙键、肟键和席夫碱键 。形成亚胺键的典型方法是伯胺与醛进行缩合反应,其缩合与水解均可在水环境中发生,从而可在水溶液中形成交联网络结构,实现水凝胶的制备 。
亚胺键的形成和断裂可以通过酸碱、氧化还原,以及离子强度等因素控制 。Zhou等 通过提高硫酸软骨素(CS)醛的氧化度加快了醛基与明胶(Gel)的游离氨基形成亚胺键的反应速率,将Gel-CS凝胶的凝胶化时间从13.0 min缩短到0.8 min,使其有望成为一种组织黏合剂[见 图1 (A)]。
图1 基于动态共价键的黏弹性可调复合水凝胶的交联策略
改变交联网络中亚胺键的总量不仅可以整体控制水凝胶的力学性能,还可以对储能模量( G ′)和损耗模量( G ″)进行独立调控,以匹配组织特异性的力学轮廓。Liu等 通过固定甲基丙烯酰化明胶(GelMA)基水凝胶的共价交联密度,改变席夫碱键和硼酸酯键的总量构建了G′(～4 kPa)相似, G ″与 G ′比值分别为0.02、0.21、0.32的黏弹性水凝胶系统,将有助于阐明细胞和ECM动力学之间的关系 。
作为可受多种化学或生物刺激发生可逆反应的动态共价键之一,二硫键也长期被用来设计性能优良的多功能水凝胶 。根据应用场景以及所处环境的不同,可通过改变力、光照以及氧化还原电势等条件,实现对基于二硫键的水凝胶的网络结构的调控 。Yang等 利用二硫键的光可控性证明了在紫外光照射下聚丙烯酰胺(PAM)单网络水凝胶显现出明显的应力松弛行为。除了各种外界刺激,二硫键所处的化学环境也对其动态平衡产生了极大的影响。相比于脂肪族二硫化物,芳香族二硫化物在发生二硫键交换时所需条件更加简单,无需额外添加温度、催化剂等外部刺激,在室温下即可实现二硫键的快速破坏与重排 。Boahen等 利用这一特性设计了一种具有较高的自主自愈合速度(4.3 μm/min)和自愈合效率(60 min内91%)的电子皮肤[见 图1 (B)],将有望应用于可穿戴医疗领域中的人机接口。
硼酸酯键是一种典型的动态共价键,通常由硼酸及其衍生物与顺式1、2-二醇或顺式1、3-二醇之间的加成反应形成,其中包含的B-O键可在pH、糖浓度以及金属配位等多种因素的调节下,进行动态更替,从而实现键的解离与重构 。硼酸酯键具有快速的交换速率,基于硼酸酯键的水凝胶的松弛时间常数通常可在1 s及其以下的量级内进行调控,从而满足不同的应用需求 。Wang等 在GelMA基水凝胶中引入苯硼酸(PBA),使其作为蛋白聚糖的“传感器”,利用二者之间的可逆共价相互作用改善了水凝胶的应力松弛特性,从而通过物理线索调控了软骨细胞的行为,促进了软骨组织再生。但是在人体复杂的生理或病理环境中,往往需要处理多重刺激同时作用的情况,Guo等 将具有葡萄糖响应的甲基丙烯酰胺苯硼酸(MPBA)与具有温度响应的N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)进行有效结合,设计了一种具有“三明治”结构的两性离子皮肤传感器,从而可以实时监测和区分创面的温度、葡萄糖浓度和应变,并促进糖尿病创面的愈合[见 图1 (C)]。
Diels-Alder(DA)反应又叫双稀加成反应,即二烯试剂与亲二烯试剂之间发生的环加成反应 。由DA反应生成的Diels-Alder键具有可逆性、反应温和性以及高度特异性,使其非常适用于药物递送、细胞培养以及生物标记和探针的开发等功能化领域 。Smith等 将Diels-Alder键引入透明质酸(HA)水凝胶中[见 图1 (D)],呋喃功能化水凝胶(HA-FA)与更富电子的甲基呋喃功能化水凝胶(HA-mF)具有相似的 G ′(1～1.3 kPa),但甲基呋喃较高的电子密度增加了DA反应的速率,使得HA-mF具有比HA-FA更短的凝胶化时间,从而更有效应用于三维细胞培养和组织工程。
DA反应可以在37 ℃生理温度和pH=7.4的条件下稳定进行,无需催化剂,也没有副产物产生,而且在相互作用过程中每对二烯和亲二烯会形成两个共价键,故在水凝胶中引入Diels-Alder键有利于增强其力学性能 。Li等 基于DA反应制备了果胶/壳聚糖(CTS)复合水凝胶,相比于通过纯物理作用制备的水凝胶,该复合水凝胶不仅显现出良好的自愈性能,还可以承受500 g重量而不受损坏。
复合水凝胶具有高含水率、优异的可拉伸性以及独特的三维结构,在生物医药和组织工程等领域具有极大的应用潜力,然而传统的复合水凝胶因其固定的交联密度以及交联方式往往限制了其广泛应用。而基于动态共价键的黏弹性可调复合水凝胶一般具备自愈合性和可注射性良好、黏弹性可调、反应温和以及可对生物组织做出刺激性响应等优势,能适用于不同的生物结构,在仿生ECM的构建、组织工程以及药物递送等领域具有广阔的应用前景。
天然ECM作为细胞生活的微环境,不仅为细胞提供结构性支撑,还为细胞的生长提供生化和生物物理线索,参与并调控细胞的力学性能和生理生化行为 。近年来,研究表明,生物物理线索,特别是ECM的力学特性在细胞的铺展、增殖、迁移、分化、凋亡和再生等方面发挥着关键作用 。黏弹性作为细胞微环境的典型力学特性,对细胞行为的调控作用备受关注。基于不同分子机制所构筑的各类黏弹性水凝胶,可作为构建细胞外微环境的理想材料 ,为探索基质黏弹性调控细胞行为搭建良好平台。Tang等 基于硼酸酯键制备了具有应力松弛特性的水凝胶,其松弛时间约为秒或更短的时间尺度;结果发现,快速松弛基质可促进细胞-基质相互作用,导致细胞铺展和核体积增加,并在更长的时间内诱导YAP/TAZ(Yes相关蛋白和PDZ结合基序)核定位[见 图2 (A)]。Wei等 分别利用基于亚胺键的动态水凝胶(D-水凝胶)以及基于共价键的静态水凝胶(N-水凝胶)探究黏弹性对人内皮集落形成细胞(ECFC)表型的影响。观察发现,具有较高网络动力学水平的D-水凝胶允许细胞收缩性介导的整合素聚集和FA激酶(FAK)激活,更快地促进了血管形态发生。
图2 基于动态共价键的黏弹性可调复合水凝胶在仿生ECM的构建中的应用
Liu等 也基于亚胺键制备了初始模量和纤维密度恒定,应力松弛速率可进行微调控的纳米纤维水凝胶,半应力松弛时间( τ 1/2 )分别为5.49、2.14、1.49 s,并探究细胞对应力松弛的应答机制。结果表明,具有快速应力松弛速率的水凝胶基质通过分子传感器-TRPV4增强钙离子内流,从而促进MC3T3-E1细胞铺展和分化[见 图2 (B)]。
此外,黏弹性水凝胶因其模拟干细胞生态位微环境的力学和生化特性也被广泛用作干细胞递送的生物材料。Tavakoli等 基于噻唑烷键和二硫键开发的双重交联HA-水凝胶具有快速的凝胶动力学,并保持了细胞的高活力,为细胞增殖和迁移提供了支撑,满足了成功3D打印干细胞的要求,为细胞治疗和再生医学提供了更有前途的解决方案。
天然ECM通常具有高度复杂的力学结构,想要精确模拟其动态特性仍具有挑战性。基于动态共价键的黏弹性可调复合水凝胶具有良好的生物相容性、三维聚合物网络结构,可作为支架促进细胞生长,同时通过调控其黏弹性,可为细胞提供与天然ECM相近的动态力学微环境,从而促进组织再生与功能修复 。Wang等 利用二硫键形成的动态巯基改性透明质酸(HASH)水凝胶模仿体内黏弹性微环境,并促进了全层皮肤缺损的愈合。
已有研究表明,黏弹性水凝胶的应力松弛特性影响间充质基质细胞分化以及内皮细胞血管生成等,但在人类大脑发育模型中,它尚未得到充分的研究 。而人类的脑组织也具有黏弹性力学特征,Roth等 利用HA和弹性蛋白(ELP)开发了一种刚度相似( G ′～0.8 kPa)、应力松弛速率不同的蛋白质工程生物材料HELP(见 图3 )。将HELP水凝胶用于人诱导多能干细胞来源的神经祖细胞(hNPCs)的三维培养,结果显示,快速应力松弛的水凝胶可促进神经突起的延伸并驱动体内和体外的神经成熟。
图3 可调黏弹性水凝胶促进hNPC培养和神经突延伸
由于稳定的三维网络结构以及良好的生物相容性,水凝胶早已成为了包载药物并实现其持续释放的重要载体 。相比于传统的药物递送系统,引入动态共价键的黏弹性可调复合水凝胶不仅赋予水凝胶良好的可注射性,方便包载药物的凝胶载体作用于病灶部位,而且亚胺键、硼酸酯键、二硫键以及Diels-Alder键等动态共价键在葡萄糖、温度以及pH等多种刺激条件下表现出优良的动态可逆性,从而可实现药物在特定环境下的可控释放与靶向递送。Wu等 基于聚乙烯亚胺(PEI)支链被PBA功能化的PEI-PBA和聚乙烯醇(PVA)形成的具有pH响应性的硼酸酯键,实现了水凝胶持续给药的功能(见 图4 ),有望为癌症治疗提供一种具有低毒性和高药物传递效果的pH响应递送系统。Qiao等 利用硼酸酯键对活性氧(ROS)的响应性实现了抗菌与抗炎药物的时空顺序递送,对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的皮肤伤口修复具有显著促进作用。 表1 总结了基于动态共价键的黏弹性可调复合水凝胶的力学性能与应用。
表1 基于动态共价键的黏弹性可调复合水凝胶的力学性能与应用总结
图4 PBA-PEI/PVA水凝胶的制备及释药过程示意图
本文总结了基于亚胺键、硼酸酯键、二硫键以及Diels-Alder键4种交联策略的黏弹性可调的复合水凝胶的构筑机制、研究进展,并简单介绍该复合水凝胶在调控细胞功能、组织工程和药物递送等领域的应用现状。
基于动态共价键所构筑的复合水凝胶不仅具有优异的生物相容性、自愈合性和可注射性,还可赋予其刺激响应性和结构可调性,实现了水凝胶的可控制备。然而,基于动态共价键构筑的黏弹性可调复合水凝胶在制备方法和应用方面还存在一定的挑战与机遇。这对水凝胶结构与性能可调节的范围以及精确性提出了更高的要求,如何综合利用具有不同动力学特性的动态共价键或开发多种化学结构不同的反应物将是未来的研究热点之一。结合计算机模拟技术建立聚合物结构的理论模型,不仅可以实现对水凝胶黏弹性的精确调控,还可以进一步降低开发时间与材料成本,进而推动该复合水凝胶在生物医学应用等领域的发展实现新一代的突破。
作者贡献声明： 张思琪负责数据资料收集、整理分析和论文撰写;周昱如、刘冉负责论文修改;王艳芹负责选题设计、论文指导和修改;武晓刚、陈维毅负责论文指导和修改。
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陈维毅 
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