摘要 目的 探究力对FLNa-Ig21/αⅡbβ3-CT稳定性的影响及调控机制。方法 FLNa-Ig21/αⅡbβ3-CT晶体结构取自PDB数据库。通过平衡和拉伸分子动力学模拟,分析复合物生理环境下稳定性以及力诱导的解折叠路径和力学稳定性。结果 平衡过程中,FLNa-Ig21和αⅡbβ3-CT之间大部分盐桥和氢键的生存率小于0.5,其结合强度相对较弱;恒速度拉伸过程中,复合物可承受170～380 pN的拉力,其力学强度与力诱导的解离路径有关;在0～60 pN恒力条件下,复合物呈现“滑移键”趋势,且力的增加有利于αⅡbβ3近膜端R995-D723盐桥的解离和整合素的活化。结论 力诱导的αⅡbβ3-CT近膜端异构可增强复合物的力学强度和解离时间的后移;突破20 pN阈值后,力正向调控整合素的活化。研究结果为深入揭示整合素αⅡbβ3活化的分子机制及相关靶向药物开发提供参考。
关键词:
血小板整合素
分子动力学模拟
解折叠路径
力学强度
力学调控机制
异源二聚体αⅡbβ3作为血小板表面最主要的整合素,存在着低、中、高3种亲和力构象,在生理性止血和病理性血栓形成中发挥着重要作用 [1-2] 。正常生理环境下,整合素αⅡbβ3头部弯曲,遮盖了配体结合位点,呈现低亲和力状态以有效避免血栓形成 [3] 。当血管受损时,整合素αⅡbβ3可由内皮下锚定的血管性血友病因子(von Willbrand factor, vWF)及可溶性的血小板激动剂(二磷酸腺苷、血小板活化因子和凝血酶等)通过“由内而外”的信号通路激活至中等亲和力状态,进而结合其胞外配体(纤维原蛋白)通过“由外而内”的信号通路激活至高亲和力状态,实现血小板的稳定黏附和聚集,启动凝血级联反应 [4-5] 。
整合素β3亚基的胞质尾(cytoplasmic tail, CT)包含细丝蛋白A(filamin A, FLNa)、Talin和Kindlin等多个重要胞质分子的结合位点 [6] ,其近膜端D723与αⅡb亚基上R995形成的盐桥已被证明在整合素双向激活通路中扮演关键角色 [7] 。此外,有研究表明,FLNa-Ig21在β3-CT的结合位点为Y747-T755 [8] ,这与整合素激活剂Talin和Kindlin的结合位点W739-A750和S752-Y759有部分重叠 [9] ,故FLNa与β3的结合在一定程度上可以起到空间位阻的作用,阻断Talin和Kindlin与β3尾部的结合以抑制αⅡbβ3活化,这已得到FLNa-Ig21敲除与突变实验的验证 [10] 。一般认为,当血小板受外部激动剂或凝血酶刺激时,会诱导FLNa从β3-CT脱落,Talin竞争性结合到β3-CT近膜端的NPxY基序,解除αⅡbβ3-CT的K716-W739二硫键,从而诱导胞外构象变化至中等亲和力状态 [11] 。此外,FLNa以二聚体形式存在,并通过N端的肌动蛋白结合结构域与骨架F-actin相连[见 图1 (a)],可感受、传递循环血流微环境力学信号和胞内细胞骨架张力等力学信号 [12] 。体内外实验均证明,仅病理性的血流剪切力就足以诱导血小板的活化、聚集和血栓形成 [13-14] 。Kim等 [15] 在CHO细胞上转染αⅡbβ3,通过改变细胞外剪切力、细胞内外的渗透压、细胞拉伸和增加膜曲率等方式,发现细胞膜的物理变形能在一定程度上激活整合素αⅡbβ3,且该信号通路不依赖Talin。
图1 αⅡbβ3-CT/FLNa-Ig21复合物生理受力情况和晶体结构图
这些实验结果显示,力可能全面参与调控了αⅡbβ3与FLNa的结合和解离过程,但其调控机制和分子结构基础至今未明。为了深入探究细胞骨架拉力下复合物αⅡbβ3与FLNa相互作用的力学稳定性以及力学调控机制,本文采用分子动力学(molecular dynamics, MD)模拟手段,通过分析力信号诱导FLNa-Ig21/αⅡbβ3-CT复合物的解离过程、构象变化和结合面残基相互作用网络的演变,深入了解整合素αⅡbβ3力调控的活化机制和产生该机制的结构基础。研究结果对进一步深入理解血小板凝止血等相关的生理病理过程及相关药物的开发具有重要意义。
FLNa-Ig21/αⅡbβ3-CT复合物三维结构取自蛋白质结构数据库(protein data bank,PDB),代码为2MTP。该复合物由αⅡb-CT(残基W988-E1008)、β3-CT(残基K716-T762)以及FLNa的Ig-21结构域(残基G2336-G2330)组成。然而,由于在解析晶体结构时存在溶解度低和谱线拓宽的问题,β3亚基上存在两个点突变(L717K和L718K), 因此,通过可视化分子动力学(visual molecular dynamics, VMD)软件的AUTOPSF插件将其重新突变回野生型K717L 和K718L。使用VMD软件在每个亚基的N端和C端加入电中性补丁,以消除肽链从C端到N端的电偶极矩对MD模拟所造成的影响;调用VMD中的solvate软件包将复合物浸润在距离各边至少15 nm的TIP3P水框中;最后加入0.308 mol/L的Na + 和Cl - 离子以模拟真实生理溶液,最终原子数为38 378个。
为获得能量较低且稳定性良好的分子体系,使用纳米尺度分子动力学(nanoscale molecular dynamics, NAMD)软件在CHRMM22全原子力场条件下,按文献步骤对模拟体系进行三步能量最小化,采用周期性边界条件以消除尺寸效应 [16] 。随后在恒温(36.85 ℃)、恒压(1.013 kPa)条件下对该体系进行3次40 ns平衡模拟。运算过程中采用埃瓦尔德粒子网格(particle mesh Ewald,PME)算法计算静电相互作用,范德华相互作用截止值设为1.2 nm。
为了模拟复合物FLNa-Ig21/αⅡbβ3-CT在力作用下的稳定性和构象变化,取3次平衡中最稳定一次的最后一帧作为初始构象,进行拉伸MD模拟 [17] 。为模拟细胞骨架传递的力,将αⅡb-CT和β3-CT N端W988-Cα和K716-Cα设为固定原子,将FLNa-Ig21 C端G2330-Cα设为拉伸原子,沿两个固定原子之间的中点与拉伸原子的连线方向[见 图1 (b)],先以0.3 nm/ns速度进行3次恒速度MD模拟,虚拟弹簧常数为139 pN/nm,直至FLNa-Ig21与αⅡbβ3完全解离为止。再选取恒速度拉伸过程中受力与设定拉力(20、40和60 pN)大小相当的构象为初始构象,对各构象分别进行3次40 ns恒力拉伸MD模拟。
所有分析都在VMD软件中进行。采用重原子位置的均方根偏差(root mean square deviation,RMSD)表征蛋白构象变化和结构稳定性,结合面溶剂不可及表面积(buried solvent-accessible surface area,buried SASA)表征复合物结合面面积。氢键和盐桥定义如下:若供体原子与受体原子间的距离 d >0.35 nm且键角大于30°,则氢键存在;当酸性氨基酸侧链上任意氧原子与碱性氨基酸侧链上的氮原子形成的键长 d >0.4 nm时,盐桥形成。氢键或者盐桥的生存率定义为模拟过程其存在时长占整个模拟时长的比值;结合面残基与残基之间的结合概率计算公式参照本课题组以前的工作 [18-20] 。
本文所有数据都来自于3组独立实验,以(平均值±标准误)表示。对于多组数据,当数据符合正态分布时,采用单因素方差分析和多重比较来检验组间差异性;当数据不符合正态分布时,采用Kruskal-Wallis H检验及Nemenyi事后检验来比较组间差异。
2.1 平衡过程复合物FLNa-Ig21/αⅡbβ3-CT的稳定性及关键氢键
从核磁共振获得的FLNa-Ig21/αⅡbβ3-CT的静态三维结构来看,αⅡbβ3-CT与FLNa-Ig21的结合主要在2个区域[见 图1 (c)]:αⅡb与β3亚基的近膜区(membrane-proximal region, MP),残基序列号分别为W988-L1000和K716-W739;β3亚基的C端(C-terminal integrin β3-CT, β3-C),残基序列号为D740-T762,主要通过Y747-F754片层与FLNa-Ig21C和D片层形成的凹槽相结合。为了评估复合物在生理环境中的稳定性,并为后续拉伸模拟提供稳定的初始构象,本文基于能量最小化构象,对其进行3次40 ns平衡模拟(见 图2 )。结果显示,在20 ns后,复合物的RMSD和结合能均在某一水平小幅波动,但3次重复的差异较大,推断是由于αⅡbβ3 C端柔软的loop波动导致。在去除整合素L1000-E1008和N756-T762 2小段loop结构后,3次平衡的RMSD曲线基本重合,在10 ns后就基本稳定在0.4 nm,这证明了本研究的猜想,并表明该系统已达到平衡[见 图2 (a)]。通过对平衡过程中复合物结合面氢键与盐桥数目的统计,3次平衡模拟的平均氢键和盐桥数在16～19之间,且均符合正态分布,这意味着取样空间完备。综合3次平衡模拟数据,第2次模拟具有较低的RMSD、较高的结合能和平均氢键(和盐桥)数,复合物的稳定性更好。因此,将其最后一帧构象作为后续生产性模拟的初始构象。
图2 平衡过程中复合物FLNa-Ig21/αⅡbβ3-CT的稳定性
同时,本文追踪了复合物接触面残基相互作用的动态变化,并用氢键和盐桥的生存率来度量残基相互作用的强度以及它们对复合物结构稳定性的贡献,平均生存率高于0.30的氢键和盐桥列于 表1 。可以发现,FLNa-Ig21与αⅡbβ3-CT的相互作用主要集中在β3亚基,尤其Y747-F754片层对维持复合物结构稳定性发挥关键作用,主要通过E749-V2275、T751-I2273之间的强氢键;K748-E2276、E749-K2280之间兼有较强的盐桥和相对较弱的氢键。此外,FLNa-Ig21与αⅡbβ3-MP的相互作用较弱,与β3-MP形成了3对较弱的氢键,与αⅡb-MP则通过K994-E2323之间较强的盐桥和较弱的氢键。Liu等 [10] 采用表面等离子体共振技术测量FLNa-Ig21与αⅡb-CT、β3-MP以及β3-C的结合亲和力,发现FLNa-Ig21与β3-C的结合亲和力比其与αⅡb-CT或β3-MP的亲和力高数10倍,而K994和E2276的突变则会终止和减弱FLNa-Ig21与αⅡb-CT、β3-C的相互作用。该研究结果也从实验方面证实了本文模拟结果的可靠性。
表1 平衡过程中FLNA-Ig21/αⅡbβ3-CT结合面重要的氢键和盐桥(生存率≥0.30)
2.2 FLNa-Ig21/αⅡbβ3-CT的力学强度及力诱导的解离
从平衡模拟中可以发现,FLNa-Ig21/αⅡbβ3-CT复合物结合面的氢键(和盐桥)平均生存率均低于90%,且大多数都低于50%,这意味着其结合亲和力并不是很强。为探究该复合物的力学强度及细胞骨架力诱导的解离过程,基于平衡构象,本文对该复合物进行3次恒速度SMD模拟,每次拉伸时间不做限定,直到FLNa-Ig21与αⅡbβ3-CT完全解离为止。拉伸过程中的力谱曲线、结合面溶剂不可及表面积和氢键数目随时间的变化如 图3 所示。在前4 ns,拉力经历稳定增加至150 pN,且3次的爬坡曲线高度重合,随后3次模拟则呈现很大的差异。第1次恒速拉伸,约4 ns后拉力有轻微下降,伴随结合面面积的略微减少;接着拉力又继续上升,约15 ns达到最大峰值约380 pN,期间结合面面积和氢键数目基本稳定;最后,拉力陡然下降至0附近波动,结合面面积和结合面氢键(和盐桥)数目均呈现先断崖式下降再逐渐下降的过程,约35 ns时复合物完全解离。第2次恒速拉伸,在4 ns急速爬坡后,拉力继续波动上升,约15 ns达到最高峰约250 pN,期间结合面面积持续下降,而氢键数目则在10附近大幅波动;随后拉力急剧下降接近0,但很快又上升,约28 ns时到达第2峰值150 pN,这阶段结合面面积和氢键数目基本维持在一个较低水平波动;最后,随拉力下降,结合面面积和氢键数目进一步减少,36 ns时复合物完全解离。第3次恒速拉伸的力谱曲线与第2次恒速拉伸较为类似,但最大峰值仅为170 pN,时间提前到9 ns;第2峰约为100 pN,时间为21 ns;27 ns时复合物已完全解离。
图3 复合物FLNa-Ig21/αⅡbβ3-CT恒速度拉伸模拟
假如将恒速拉伸过程中复合物力谱的最大峰值定义为断裂力,即复合物所能承受的最大力,反映其力学强度。3次拉伸模拟所得的断裂力在170～380 pN之间,三者存在有较大差异。结合相应的溶剂不可及表面积、氢键和盐桥数目随时间的变化,可以发现复合物的力学强度与解离时间存在一定的相关性:当力学强度高于250 pN时,解离时间大约在35 ns;而力学强度低于200 pN时,解离时间则小于30 ns。该结果提示,在复杂的力学微环境中,复合物可能拥有多种解离路径。
2.3 力诱导的FLNa-Ig21/αⅡbβ3-CT的解离路径和构象变化
为进一步探明复合物力学强度与解离路径的关系,本文跟踪了每次恒速度拉伸过程中复合物结合面残基相互作用随时间的演化以及复合物构象的变化(见 图4 )。从接触面氢键与盐桥的动态变化来看,3次模拟均以FLNa-Ig21与αⅡbβ3-MP之间残基对的断裂为开端,接着与β3之Y747-F754片层、C端loop之间的氢键和盐桥也依次断裂,复合物解离。第1次和第3次恒速拉伸中,最大力峰均发生在αⅡb-MP与FLNa-Ig21之间K994-E2313氢键和盐桥断裂时,但前者β3-MP与FLNa-Ig21之间的3对氢键和盐桥稍后断裂,而后者则断裂在先;结合最大断裂力时的结构快照,可以发现前者的β3-MP α螺旋发生了部分解折叠,而后者保持完好,这意味着该力诱导的β3-MP的异构有利于维持其与配体的相互作用,导致断裂力的上升和断裂时间的后移。第2次恒速拉伸中,αⅡbβ3-MP与FLNa-Ig21的5对氢键和盐桥的断裂均发生在最大力峰前,但几乎同时新增了R760-2287残基对之间的氢键和盐桥,以防止复合物失稳;最大力峰时,β3-MP α螺旋已经完全解折叠且离开FLNa-Ig21,但β3后面的Y747-F754片层与配体的凹槽结合面维持完好,依然具有一定的力学强度以避免外力的破坏。比较第1次和第2次恒速拉伸最大峰值时的快照,β3-MP α螺旋的部分解折叠维持了αⅡbβ3-MP与配体残基对之间的相互作用,极大提高了断裂力,但过大的断裂力将Y747-F754片层部分拉离了结合凹槽,导致拉力的快速下降直至复合物解离。另外,在第1次和第2次恒速拉伸中均发现FLNa-Ig21的βG片层拉出;第3次恒速拉伸由于断裂力过低,αⅡbβ3-CT和FLNa-Ig21均未发生明显的异构。
图4 FLNa-Ig21与αⅡbβ3-CT的解离过程和构象变化
综上所述,本文模拟结果表明,复合物αⅡbβ3-CT/FLNa-Ig21的力学强度确实与解离路径密切相关,力诱导的β3-MP α螺旋的部分或完全解折叠有利于增加复合物的力学强度以抵抗外力的破坏,避免整合素不必要的激活。
2.4 FLNa-Ig21/αⅡbβ3-CT复合物的力学稳定性
在正常生理条件下,αⅡbβ3-CT/FLNa-Ig21可能承受的力远小于其断裂力,且拉力过快增加会遮蔽细微的结构变化。因此,在恒速拉伸的基础上又进行了恒力拉伸模拟。在0、20、40和60 pN拉力条件下,探究力对复合物稳定性的影响。
不同恒力下,平均的Cα-RMSD时间历程表明,30 ns后复合物已基本达到稳定,而且施加力有利于增强复合物的整体稳定性[见 图5 (a)]。但追踪结合面氢键与盐桥的数目、结合面面积和相互作用能,发现三者之间的数据并不互相支持:氢键与盐桥的数目随力的增加,呈现先减少、后增大的趋势,40 pN时达到最小值;结合面溶剂不可及表面积则随力的增加呈现单向下降的趋势;结合能未呈现规律变化,0 pN时数值最高,20 pN时数值最低[见 图5 (b)～(d)]。通过观察模拟轨迹动画,未发现明显的变构行为,说明复合物内部相互作用相对稳定。
图5 恒力拉伸过程中FLNa-Ig21/αⅡbβ3-CT 稳定性(
接着,分析并计算不同恒力模拟过程中复合物接触面残基对相互作用的生存率,并制成热图,发现αⅡb-MP及β3 Y747-F754片层与FLNa-Ig21之间的4对残基:K994-E2313、K748-E2276、E749-V2275和E749-K2280对复合物的力学稳定性起着关键作用。同时,β3-MP与FLNa-Ig21之间的6对残基相互作用,有5对与力的增加呈现负相关关系[见 图6 (a)]。因此,本文推测,力的增加有利于β3-MP从FLNa-Ig21中解离。同时,求证β3-MP与FLNa-Ig21之间的质心距离,它们之间的质心距离越短,则结合越牢固,反之越松散。结果表明:随着力的增加,质心距离确实单调上升[见 图6 (b)]。该结果提示,20～60 pN力对β3-MP与配体结合的影响显著,进而可能影响β3-MP与αⅡb-MP的相互作用。
有研究表明,αⅡbβ3-MP一对盐桥R995-D723的解离在αⅡbβ3由内而外的活化通路中发挥关键作用 [7] 。因此,本文分析计算了不同恒力下该盐桥的生存率以及αⅡbβ3-MP的结合能。结果显示,随着力的增加,αⅡbβ3-MP的结合能数值单调下降,即随着β3-MP与FLNa-Ig21之间的质心距离的增大,β3-MP与αⅡb-MP的相互作用也随之减弱;同时,R995-D723盐桥生存率呈现先上升后下降的趋势,20 pN时达到最大值[见 图6 (c)、(d)]。
综上所述,尽管本模拟数据之间不能完全统一或充分地相互支持,但呈现的力学调控机制基本一致:即随力从20 pN增大,FLNa-Ig21与αⅡbβ3-CT的接触面面积减少,主要归因于β3-MP与FLNa-Ig21之间残基对相互作用的减弱和两者质心距离的增大;进而削弱β3-MP与αⅡb-MP的相互作用,使关键R995-D723盐桥的生存率下降,从而有利于血小板整合素的活化。
体内外实验及临床病例均证明FLNa对血小板整合素αⅡbβ3激活有负调控作用 [21] ,关于FLNa究竟如何从整合素αⅡbβ3胞质域脱落和激活整合素,有研究提出“配体竞争性结合诱导解离模型”和“力诱导的复合物构象改变解离模型”两种假说 [22] ,但由于体内及细胞内环境的复杂性,一直未能证实。
基于Liu等 [10] 采用核磁共振技术解析得到的αⅡbβ3-CT/FLNa-Ig21复合物三维结构,采用恒速度拉伸和系列恒力拉伸的MD模拟,本文系统探索了复合物的力学强度、解离路径以及力诱导的整合素活化。结果发现,β3-MP之α螺旋的部分或完全解折叠分别有助β3-MP或Y747-F754片层与FLNa-Ig21的结合,导致断裂力的增加和解离时间的延迟,这种力诱导的异构可提高复合物的力学强度以抵抗外力破坏的现象,已广泛发现于β3/Talin-F3、β1/Talin-F3及CD44/HA等分子系统 [18-19,23] 。但是与这些分子系统不同的是:在恒力拉伸模拟过程中,随着拉力的增加,αⅡbβ3-CT与FLNa-Ig21之间没有发现“逆锁键”现象,更多呈现“滑移键”趋势,即力的增加减弱了FLNa-Ig21与αⅡbβ3-CT之间的相互作用,尤其是与β3-MP之间的结合,进而影响αⅡb-MP与β3-MP的结合强度。同时,被认为是整合素激活开关的R995-D723之间的盐桥,表现出力调控“逆锁键”机制,最佳阈值出现在20 pN,远低于同等拉伸模拟条件下β3/Talin-F3的阈值60 pN [18] 。系列恒力拉伸的模拟结果表明,β3-MP/FLNa-Ig21力学稳定性较差,容易导致R995-D723盐桥的断裂和β3整合素的激活,比较Talin与β3-CT结合表现的良好力学稳定性,从一定程度上证明Talin与β3-CT结合的竞争力要优于FLNa-Ig21。
由于整合素胞内结构的特殊性以及构建合理细胞膜的困难性,本文的模拟数据不能得到直接实验数据的支持;另外,由于计算资源的限制和尺度效应,计算模拟条件包括拉伸速度和拉力是远高于生理条件。但本模拟结果不仅在原子水平展示了“力诱导的复合物构象改变解离模型”,而且从一定程度上解释了“配体竞争性结合诱导解离模型”,使两个假设达到了很好的统一。此外,本文还细致分析了力对复合物内部残基相互作用对的影响,这对于全方位深入理解力诱导的血小板整合素的活化机制以及抗血栓靶向药物的开发具有启发和参考价值。
作者贡献声明： 任建芳负责选题和研究实施、数据的采集与分析、整理和排版论文图片,并协助论文撰写和修改;罗毅冲负责论文撰写及协助数据分析;吴建华负责研究设计;方颖负责研究和数据分析指导以及论文指导与修改。
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