摘要 目的 探讨流体剪切力(fluid shear stress,FSS)对成骨细胞p21表达的影响,并明确p21在 FSS诱导的成骨细胞增殖过程中的作用。方法 对成骨细胞加载不同时间(0、15、30、45、60 min)、1.2 Pa FSS。用CCK-8实验、EdU实验检测成骨细胞增殖活性。用siRNA p21或pcDNA p21转染成骨细胞,并用Western blotting检测转染效果。Western blotting检测不同干预条件下p21、cyclin D1、CDK4的表达变化。结果 加载 1.2 Pa FSS后,p21表达显著下调,且加载45 min后表达水平最低。加载FSS和下调p21表达都显著增强成骨细胞增殖,并增加cyclin D1、CDK4表达。而上调p21表达后,加载FSS不再具有增强成骨细胞增殖和增加cyclin D1、CDK4表达的作用。结论 1.2 Pa FSS能够下调成骨细胞p21表达,在加载45 min时下调最为明显。p21下调对成骨细胞增殖具有促进作用,且FSS通过下调p21促进成骨细胞增殖。
关键词:
流体剪切力
成骨细胞
细胞增殖
随着人口老龄化的日益加剧,骨质疏松症已经成为全世界面临的严重公共健康问题。调查结果显示,2019年我国50岁以上人群骨质疏松症的患病率高达19.2%,而且随着年龄的增长,患病率也呈明显的上升趋势 [1] 。骨质疏松症不仅影响患者的生活质量,其严重的并发症还可能导致患者残疾甚至死亡 [2-3] 。成骨细胞新骨形成和破骨细胞旧骨吸收过程通常处于动态平衡状态,当骨形成不足或骨吸收过快时,机体会发生骨质流失,从而引起骨质疏松症 [4-5] 。深入研究骨质疏松症发生的内在机制,对骨质疏松症的防治非常重要。
研究发现,在失重、长期卧床、肢体石膏固定等力学负荷减轻的情况下,人体发生骨质疏松及相关骨折的风险明显增加,说明力学因素对骨代谢具有重要作用 [6] 。人体骨组织处在复杂的力学环境中,这些应力包括流体剪切力(fluid shear stress,FSS)、牵张力、剪切力、压应力等 [7-8] 。Basso等 [9] 研究发现,FSS是影响骨代谢的主要力学因素。FSS能够影响成骨细胞增殖、凋亡、分化等生物学行为 [10-12] 。
p21是一种由CDKN1A基因编码的蛋白。研究发现,氟化钠处理成骨细胞后,细胞p21表达下调,成骨细胞增殖增加 [13] 。此外,Blaber等 [14] 研究发现,小鼠在进行15 d航天飞行后,股骨近端骨膜表面的成骨细胞p21表达增多,推测其可能与失重条件诱导的骨丢失有关。然而,p21是否参与力学因素对成骨细胞生物学行为的影响,仍需进一步研究去证实。本实验以FSS作为力学刺激,研究成骨细胞p21在FSS作用下的表达变化,并探讨p21在FSS诱导成骨细胞增殖中的作用,以期为骨质疏松治疗提供新的治疗靶点。
α-MEM基础培养基(Hyclone公司,美国);胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司,美国),青-链霉素、封闭液、4%多聚甲醛(上海碧云天生物技术有限公司);RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);CCK-8试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司);EdU染色试剂(广州锐博生物技术公司);Triton X-100、β-actin抗体(1∶2 000)、山羊抗鼠二抗(1∶5 000)、山羊抗兔二抗(1∶5 000)(北京中杉金桥生物技术有限公司);p21抗体(1∶1 000)(Proteintech公司,美国);CDK4抗体(1∶1 000)、cyclin D1抗体(1∶1 000)(CST公司,美国);GP-transfect-Mate转染试剂(上海吉玛制药技术有限公司)。
实验所用小鼠MC3T3-E1成骨细胞购自北京协和细胞技术资源中心。用α-MEM基础培养基、胎牛血清和青-链霉素配制成10%的完全培养基,用于培养MC3T3-E1成骨细胞。细胞放入37 ℃、5%CO 2 细胞培养箱中培养,待成骨细胞生长至80%～90%或者出现接触抑制时,进行传代。
将无菌盖玻片放入培养皿备用。取1瓶生长至80%～90%的成骨细胞,用胰蛋白酶将细胞消化下来,并将细胞密度稀释至1×10 6 /mL。取800 μL稀释好的细胞悬液小心地滴在盖玻片上,然后将培养皿放入细胞培养箱中,待细胞贴壁后再向培养皿中加入6 mL完全培养基过夜。打开FSS加载装置(专利号:ZL201520637211.6),夹取爬有细胞的盖玻片,将细胞贴壁的一面朝上放入装置平行板凹槽中。设置FSS强度为1.2 Pa,根据需要设置加载时间为15、30、45、60 min,启动装置加载FSS。
将对照组和干预组细胞以同一密度接种在96孔板上,每组设5个复孔,并设置1组仅含有完全培养基的空白组。分别在细胞贴壁后0、24、48、72 h,从培养箱中取出96孔板,每孔加入10 μL CCK-8溶液,再将96孔板放入培养箱中培养2 h后,酶标仪检测在450 nm处的OD值。
将RIPA裂解液和PMSF按1∶100配制成蛋白裂解液。取对照组或干预组细胞,加入蛋白裂解液裂解30 min。收集含有细胞碎片的裂解液,12 000 r/min离心20 min,留取上清液。按照BCA试剂盒说明书,计算样品蛋白浓度,加入上样缓冲液后煮沸备用。蛋白样品在10% SDS-PAGE凝胶中电泳,随后转膜、封闭(1 h)。封闭结束,一抗孵育2 h,4 ℃冰箱过夜。TBST洗涤3遍,二抗孵育1 h。TBST洗涤3遍,曝光条带,用Image J软件计算灰度值。
实验所用siRNA-nc、siRNA p21、对照质粒空载体pcDNA 3.1、pcDNA p21过表达质粒由上海吉玛制药技术有限公司负责构建合成。按照说明书,将基础培养基分别与转染试剂或siRNA/pcDNA混匀,然后静置5 min,再将两者混合,静置20 min制成转染复合物。细胞用新鲜培养基换液后,加入转染复合物,siRNA终浓度不低于50 nmol/L,DNA为0.5～1.5 μg(24孔板为例,细胞培养量不同,则依据说明书调整剂量)。37 ℃培养6 h,更换为完全培养基后继续培养。72 h后提取蛋白,检测p21的蛋白表达量。
细胞接种于盖玻片上,贴壁后在50 μmol/L EdU培养基中孵育2 h,PBS洗涤2遍。4%多聚甲醛固定30 min后弃去。2 mg/mL甘氨酸中和多聚甲醛5 min后PBS洗涤2遍。0.5% Triton X-100孵育10 min后PBS洗涤2遍。制备Apollo染色反应液避光染色30 min后弃去。加入0.5% Triton X-100洗涤10 min。甲醇洗涤2遍。Hoechst 33342避光染色30 min,PBS洗涤后立即观察。
所有实验均进行3次重复,结果以均值±标准差表示。使用GraphPad Prism 8.0软件进行数据统计学分析,两组间比较用 t 检验,两组以上组间比较用单因素方差分析, P <0.05表示差异有统计学意义。
研究发现,生理FSS强度为0.8～3.0 Pa [15] 。目前,研究多以1.2 Pa FSS刺激成骨细胞 [16] 。因此,本文设置1.2 Pa作为FSS的实验强度,设置0、15、30、45、60 min加载时间梯度,探究FSS影响成骨细胞p21表达的最适作用时间。
结果表明,加载1.2 Pa FSS后,成骨细胞p21表达显著下调,并且随着FSS作用时间的延长,表达水平逐渐降低。其中,在加载45 min时,p21表达水平最低(见 图1 )。在后续实验中,FSS均设置为1.2 Pa、45 min。
本文验证加载1.2 Pa、45 min的FSS对成骨细胞增殖的作用。采用CCK-8实验检测成骨细胞增殖的变化,Western blotting检测成骨细胞增殖相关蛋白cyclin D1和CDK4的变化。结果表明,与对照组相比,加载FSS后,成骨细胞的增殖活性显著增强[见 图2 (a)]。相较于对照组,加载FSS后成骨细胞cyclin D1、CDK4的表达显著上调,p21表达显著下调[见 图2 (b)～(e)]。
本文进一步探究p21下调在成骨细胞增殖中的作用。利用小干扰RNA(siRNA)转染成骨细胞,从而下调p21的表达。共设计3条siRNA,序列分别为UCUGAGCGGCCUGAAGAUUTTAAUCUUCAGGCCGCUCAGATT、CCAGCCUGACAGAUUUCUATTUAGAAAUCUGUCAGGCUGGTT、GCAGAUUGGUCUUCUGCAATT UUGCAGAAGACCAAUCUGCTT。利用Western blotting实验验证干扰效率。
结果表明,与对照组相比,转染siRNA-nc对成骨细胞p21蛋白表达没有显著影响,转染siRNA p21后,成骨细胞p21蛋白表达显著下调,siRNA #1、#2、#3对p21蛋白表达的干扰效率分别为(57.47±6.43)%、(70.95±2.52)%、(55.17±1.36)%(见 图3 )。可以看出,siRNA #2对p21表达的干扰效率最高,故选择siRNA #2作为后续实验的siRNA p21。
为了明确p21下调对成骨细胞增殖的影响,将成骨细胞分为对照组、siRNA-nc组和siRNA p21组,转染完毕后爬片,进行EdU染色。结果表明,细胞核显示红色荧光表示细胞正在进行DNA复制,以红色荧光细胞占视野总细胞的比率代表细胞增殖率[见 图4 (a)～(b)]。相较于对照组,siRNA-nc组细胞增殖率无明显变化,而siRNA p21组细胞增殖率显著升高。在siRNA转染72 h后,分别提取各组细胞蛋白质,Western blotting检测细胞增殖相关蛋白cyclin D1、CDK4以及p21的表达变化。与对照组相比,转染siRNA-nc对成骨细胞cyclin D1、CDK4和p21无明显影响,而转染siRNA p21后,p21表达显著下调,cyclin D1、CDK4表达显著上调[见 图4 (c)～(f)]。
基于以上实验结果,对p21是否参与FSS诱导的成骨细胞增殖过程开展进一步研究。细胞转染pcDNA p21过表达质粒,转染72 h后提取对照组和干预组成骨细胞蛋白质。结果表明,与对照组相比,pcDNA p21组成骨细胞p21蛋白表达水平显著上调[见 图5 (a)～(b)]。
为了明确p21在FSS诱导的成骨细胞增殖中的作用,将细胞分为对照组、FSS组、FSS + pcDNA 3.1组和FSS + pcDNA p21组,利用EdU染色检测成骨细胞增殖情况,利用Western blotting检测成骨细胞增殖相关蛋白表达的变化。相较于对照组,加载FSS后,成骨细胞增殖率显著增加,转染pcDNA3.1不影响FSS对成骨细胞增殖的促进作用,而上调p21后,这一促进作用被逆转[见 图5 (c)～(d)]。Western blotting检测细胞增殖相关蛋白cyclin D1、CDK4以及p21的表达变化。结果发现,加载FSS后,成骨细胞CDK4、CyclinD1的表达显著上调,而p21上调后,FSS对CDK4、cyclinD1表达的上调作用被逆转,进一步说明p21参与了FSS诱导的成骨细胞增殖过程[见 图5 (e)～(h)]。
骨是一种动态组织,新骨形成和陈旧骨吸收维持着骨代谢平衡。成骨细胞是负责新骨形成的主要细胞,能够合成I型胶原蛋白、骨钙素和其他组成骨骼主要成分的蛋白质,并促进骨基质矿化 [17-18] 。成骨细胞是一种力学敏感细胞,能够对力学刺激做出生物学反应。本实验以FSS作为力学刺激,对FSS影响成骨细胞增殖的内在分子机制进行研究。
结果发现,加载FSS后,成骨细胞p21表达显著下调。此外,加载FSS和下调p21均能促进成骨细胞增殖。而当上调p21表达后,加载FSS不再对成骨细胞增殖具有促进作用,表明FSS通过下调p21促进成骨细胞增殖。
近年来,力学因素对骨代谢的影响已经成为一个研究热点。各种力学刺激通过整合素-细胞骨架-核基质、阳离子通道以及G蛋白依赖通路等途径转化为细胞内的生物化学信号,调节成骨和破骨细胞的骨形成和骨吸收过程 [19] 。目前认为,FSS是影响骨代谢的主要力学因素。日常生活中,爬楼梯、跑步,甚至单纯的站立都会对骨骼产生机械负荷,导致骨基质形变。骨组织小管-腔隙网络中含有丰富的细胞外液,力学刺激引起的骨基质形变在小管内产生压力梯度,驱动细胞外液流动,从而在骨组织细胞膜上产生FSS [20-21] 。Liu等 [22] 研究发现,受到FSS刺激后,成骨细胞形态变得狭长,并沿着力的方向重新排列生长。FSS强度是影响其生物学效应的因素之一。Xu等 [23] 研究指出,1.2 Pa FSS刺激成骨细胞后,细胞出现重新排列的趋势,但0.3 Pa 的FSS对成骨细胞无明显影响。此外,FSS还能够抑制成骨细胞凋亡,促进细胞分化。Pavalko等 [24] 研究发现,加载FSS抑制了TNF-α诱导的成骨细胞凋亡。Geng等 [11] 的研究也支持FSS抑制成骨细胞凋亡的结论,并发现下调ERK5后,FSS的凋亡抑制作用被逆转。Zhao等 [12] 研究加载持续性和间歇性FSS对成骨细胞分化的影响,发现两种模式的FSS均能促进成骨细胞分化,且间歇性FSS的作用更为明显。
本实验主要关注FSS对成骨细胞增殖的影响。研究已证实,适宜的FSS对成骨细胞增殖具有促进作用。Li等 [10] 采用每隔30 min加载FSS 30 min的方式刺激成骨细胞4 h,发现细胞增殖显著增加,而且这一增殖促进效应与ERK5信号通路的激活有关。后续研究指出,FSS对成骨细胞 ERK5信号通路的激活,与NFATc1和Gαq的表达增加有关 [25-26] 。Zhang等 [27] 研究表明,KLF4也参与FSS诱导的成骨细胞增殖过程,其表达上调受到ERK5信号通路的调控。另外,FSS还能调控成骨细胞非编码RNA,如miR-140-5p、lncRNA TUG1的表达,促进成骨细胞的增殖 [28-29] 。本实验也得出FSS对成骨细胞的增殖具有促进作用的结论。此外,本文还发现,p21是FSS诱导成骨细胞增殖过程中的关键分子之一。
p21属于CDK抑制蛋白(CDK inhibitor,CKI)家族成员,被认为是控制细胞周期从G1期向S期转变的主要检查点 [30-31] 。一般认为,p21是一种肿瘤抑制基因。研究发现,p21基因缺陷的小鼠易发生原发性肿瘤,且肿瘤细胞来源涉及血细胞、上皮细胞和内皮细胞等多种细胞类型 [32] 。另有研究指出,p21在骨肉瘤组织和细胞中表达降低,并且miRNA-93和miR-140通过下调p21促进骨肉瘤细胞的增殖 [33-34] 。一项包含45例骨肉瘤样本的研究表明,p21高表达的骨肉瘤患者较低表达者肿瘤分化程度更高,显示出更好的预后 [35] 。此外,p21也与细胞增殖密切相关。小鼠p21基因功能缺失后,肝脏和神经干细胞增殖增加,处于静止状态的细胞数量减少 [36-37] 。另外,敲除p21基因也显著加速了小鼠间充质干细胞的增殖 [38] 。Pan等 [13] 在氟骨症的研究中发现,氟化钠干预后,成骨细胞p21基因甲基化水平升高,p21表达下调,细胞增殖增加。本文结果表明,p21下调在FSS诱导的成骨细胞增殖过程中具有重要作用,进一步拓展了对FSS促进成骨细胞增殖的分子机制的认识。需要注意的是,本文结果基于体外细胞实验,要准确解释体内成骨细胞的对力学刺激的反应,还需严谨的在体实验进一步验证。
FSS能够下调成骨细胞p21表达,p21下调能够促进成骨增殖,并参与FSS诱导的成骨细胞增殖过程。本研究结果加深了对力学因素影响骨代谢的理解,并为骨质疏松症研究提供一个新的角度。
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