摘要 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有成骨分化、成软骨分化、成脂肪分化等多向分化潜能,已被广泛用于基础研究和临床应用。在衰老过程中,MSCs的分化潜能会发生改变,表现为成骨分化潜能下降,而成脂分化潜能增强。衰老过程中,MSCs在分化潜能变化的同时伴有细胞物理异质性(细胞尺寸、细胞硬度、核质比等)变化。研究表明,物理异质性变化可能是导致MSCs分化潜能变化的关键因素。因此,研究MSCs衰老过程中的物理异质性变化为预测干细胞命运提供新的研究方向。本文主要综述衰老过程中物理异质性变化对MSCs分化潜能的影响,并对相应机制进行探讨。
关键词:
衰老
物理异质性
间充质干细胞
细胞体积
细胞硬度
核质比
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)来源广泛,容易获取,是一种具有多向分化潜能的细胞,具有向成骨分化、成软骨分化、成脂肪分化等潜能 [1] 。骨髓、人体脂肪、脐带血、羊水、胎盘、肝脏、大脑、肾脏中都可以获得MSCs [2-3] 。在衰老过程中,MSCs的分化潜能会发生改变,表现为成骨分化潜能下降,成脂分化潜能增强。研究表明,MSCs分化潜能与物理特征密切相关 [4] 。MSCs物理特征具有一定的异质性,具体表现为可测量的物理参数,包括细胞尺寸、细胞硬度、核质比、铺展面积等。物理异质性可以影响MSCs分化。例如:细胞的体积或者直径越大,成骨分化能力越差;反之,则成骨分化能力越强 [5] 。MSCs在生长和衰老过程中分化潜能发生变化的同时,往往伴随着物理特征的改变。例如:衰老MSCs成骨能力下降的同时,体积和硬度都会增加 [6-7] 。同时,衰老也降低了MSCs的增殖、免疫调节和归巢能力等 [8] 。衰老状况下MSCs物理异质性的变化越来越受到关注,但其中的原因与机制尚不明确。本文综述衰老过程中物理异质性变化对MSCs分化潜能的影响,并对相应机制进行探讨。
1 MSCs衰老相关机制以及衰老对MSCs分化潜能的影响
机体衰老的原因可能和干细胞衰老密切相关。干细胞发生衰老后,缺乏年轻细胞对衰老细胞进行自然更新,导致后者在体内积累 [8] 。干细胞衰老相关研究有可能提供干预衰老的新手段。衰老是由于长期累积的分子变化导致的细胞退化的渐进过程,干细胞衰老的相关机制在近些年得到广泛研究。研究表明,抑癌基因p53在干细胞衰老中起到关键作用 [9] 。细胞在发生端粒侵蚀、DNA损伤以及复制压力时,可以激活DNA损伤反应(DNA damage reaction,DDR),DDR可通过激活下游激酶磷酸化p53,干扰E3泛素连接酶(mouse double minute 2,MDM2)泛素化p53并下调p53活性,激活p53/p21cip1轴,而p21cip1是p53诱导衰老有关的细胞周期停滞在G1/S或G2/M检查点的关键因子 [9-10] 。p53主要发挥转录因子的作用,上调或下调特定目标基因的表达,这些基因参与了代谢、自噬、DNA损伤修复、细胞周期停滞、衰老和凋亡等过程 [11] 。另外,研究表明,衰老相关分泌表型(senescence associated secretory phenotype, SASP)也与干细胞衰老密切相关。SASP是衰老细胞分泌的特殊生物活性分子,包括趋化因子、细胞因子、蛋白酶和生长因子等。这些分子可以诱导周围微环境发生一系列生理反应,包括炎症、生长停滞和衰老 [12] 。mTOR是SASP的关键调节器,它能够调节MAP激酶激活的蛋白激酶2(MK2)和IL-1α的翻译 [13] 。MK2被p38磷酸化后可以使ZFP36L1失活。ZFP36L1是一种锌指蛋白,可降解许多促炎症SASP因子的mRNA, 而IL-1α促进NFκB信号传导,这与SASP基因的上调有关 [13-14] 。相应地,使用雷帕霉素抑制mTOR可以减少SASP的表达以及延缓衰老 [14] 。总之,MSCs衰老的机制得到越来越深入的研究。另一方面,MSCs在衰老过程中其分化潜能发生了显著的变化。研究发现,衰老MSCs的成骨分化能力下降而成脂分化能力增加,衰老MSCs的增殖和分化能力在总体上均发生下降 [6] 。然而,衰老影响MSCs分化潜能的相关机制仍然不清楚。研究表明,在衰老过程中,MSCs分化潜能发生变化的同时也会伴随着物理异质性变化,其体积、直径、刚度以及核质比等都发生显著改变 [15-17] 。物理异质性可能是影响MSCs衰老和分化的关键因素,为衰老MSCs分化潜能变化的相关机制研究提供崭新的研究思路。
2 衰老过程中MSCs物理异质性变化及其对MSCs分化潜能的影响
随着微流控芯片、原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)以及细胞三维重建等技术的发展,干细胞的诸多物理异质性(细胞直径、细胞体积、细胞硬度、细胞铺展面积以及细胞核质比等)可得到精确测量,这些物理异质性特征都对干细胞的分化潜能有着一定的影响(见 图1 )。研究发现,细胞铺展面积能够影响MSCs的分化能力。与具有较小铺展面积的MSCs相比,具有较大铺展面积的MSCs显示出更高的成骨分化能力 [18] 。另外,细胞体积或者直径也可以影响干细胞的命运。Guo等 [5] 利用渗透压来改变MSCs的体积,结果发现,细胞体积影响干细胞分化。体积越小,成骨分化倾向越强;体积越大,成脂分化倾向越强。Poon等 [19] 利用微流控芯片分选出两群具有不同直径的MSCs,较大的细胞群直径约为25 μm,较小的细胞群直径约为14 μm。进一步研究发现,直径较小的细胞群显示出多系分化潜能,即可以成骨分化、成软骨分化以及成脂肪分化等。而直径较大的细胞群仅显示出单系或双系分化潜能。Poon等 [19] 还发现,在相同培养条件下,较大刚度的细胞群大多显示出单系分化潜能,而较小刚度的细胞群显示出多系分化潜能。该结果表明,细胞刚度可能影响干细胞的命运,研究衰老过程中MSCs物理异质性的变化对于阐明MSCs衰老机制具有十分重要的意义。
细胞体积对细胞的功能具有重要的作用,体积影响着细胞的迁移、增殖、分化等各种生物学行为。细胞体积同时也决定了细胞生物合成能力、新陈代谢、力学性能以及分子运输的规模。一般来说,体积越大,细胞的生物合成能力越强,新陈代谢的效率越高,分子运输的规模也越大 [20] 。细胞体积的主要测量方法是使用共聚焦显微镜等仪器进行二维层面的细胞测量,然后使用软件进行三维重建。Lengefeld等 [21] 研究发现,小鼠和人类的造血干细胞在衰老过程中体积增大,干细胞体积扩大导致它们在衰老过程中的分化能力下降,如果阻止这种随年龄增长的体积扩大,可改善造血干细胞的分化潜能。Wagner等 [15] 通过研究衰老对人类MSCs功能的影响发现,经过长期培养的MSCs表现为体积变大,分化潜能下降。在MSCs的7～12代培养过程中,MSCs表现出形态变圆,体积显著增大,并最终增殖停止,而且体积增加的MSCs在后续的分化中成骨分化能力和成软骨分化能力均下降。
衰老MSCs体积增大可能与DNA损伤和细胞外基质重塑有关。每次细胞分裂,都会发生DNA损伤,“分裂”会暂时延迟以修复损伤,这种分裂延迟可能是衰老干细胞体积增大的原因 [22] 。随着细胞的生长,其分裂次数增加,而每次分裂都有可能发生DNA损伤。随着DNA损伤的积累,细胞停止分裂的时间也就越长,导致分裂的细胞在合适的时间内无法进行细胞的再分配。如果细胞分裂引起的损伤导致细胞周期检查点阻断,细胞停止分裂,大分子生物合成仍然会继续驱动细胞生长 [23] 。因此,尽管细胞体积增大,但DNA含量却没有相应增加。一旦细胞周期停滞被解除,细胞质比例恢复分裂 [23] ;分裂形成的子代细胞DNA含量不变而细胞质增加,故出现体积增加。另一方面,健康的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)对细胞体积有重要的限制作用,以避免细胞体积过大。衰老过程中,MSCs表达基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)显著上调,MMPs可以降解ECM成分,导致ECM发生重塑,并且失去了对细胞体积的调节作用,这可能也是衰老MSCs体积增大的原因之一 [24] 。Tang等 [25] 研究发现,ECM对细胞体积有一定的限制作用。当 MMP14水解细胞周围的胶原纤维后,骨骼干细胞可以迅速向周围扩散,并且铺展面积增大。同时ECM重塑可通过细胞骨架肌动蛋白(actin),经LINC复合体影响核纤层蛋白(lamin)的表达。该复合体是一组横穿核膜(nuclear envelope,NE)的蛋白,在细胞骨架和核骨架之间形成了一座桥梁,主要由SUN蛋白和KASH蛋白家族(Nesprin蛋白)组成 [26] 。而lamin影响着核内染色质状态和基因转录,是调节各种细胞过程的关键纽带 [27] 。Lamin A/C控制内核膜蛋白Emerin的定位,在没有lamin A/C的情况下,Emerin不再局限于核膜,而是向内质网膜内扩散 [28] 。Emerin能够与β-catenin结合 [28] 。Tang等 [25] 研究表明,Emerin的重新分布会导致Emerin/β-catenin复合体的错误定位,从而干扰β-catenin核转位和Wnt信号转导。而Wnt/β-catenin信号与MSCs成骨分化密切相关,这或许可以解释细胞体积影响MSCs分化的机制 [18] 。由于Lamin A/C突变可以引起早衰综合征,在衰老过程中细胞体积与核骨架蛋白的关系,以及细胞体积如何通过核骨架蛋白影响MSCs分化潜能需要深入研究 [29] 。
细胞刚度与细胞的各种功能包括迁移、黏附和力学信号的传导等有关, 当细胞受到力学作用时,它们也会调整细胞刚度来进行自我保护和力学信号传导 [30] 。细胞刚度的测量一般使用AFM来量化黏附细胞的弹性模量。MSCs在衰老过程中刚度也会发生变化。Kohler 等 [16] 研究发现肌腱组织来源的干细胞(tendon stem/progenitor cell, TSPC)显示出经典的MSCs的特征,如MSC特异性表面抗原、克隆性和三系分化(成脂、成骨和软骨),与年轻人来源的TSPCs相比,老年人TSPC中分离出的TSPCs的细胞刚度明显增加。Guo等 [13] 的研究发现MSCs体积的变化,会伴随细胞刚度的变化,衰老细胞体积变化伴随着刚度增加,说明细胞刚度变化也是干细胞衰老的重要特征。
衰老干细胞刚度增加的原因目前还不够明确。Berdyyeva等 [31] 观察到衰老内皮细胞刚度增加,使用AFM测量发现,与年轻细胞相比,衰老细胞的弹性模量持续增加2～4倍。通过观察细胞骨架后发现,衰老细胞的刚度增加是由于细胞骨架纤维的密度更高,细胞骨架更密集。衰老MSCs的肌动蛋白细胞骨架的活力降低,而且会发生重塑,推测衰老干细胞硬度发生变化的原因是衰老干细胞细胞骨架微丝发生了重塑。研究发现,细胞骨架中的纤维型肌动蛋白(fibrous actin,F-actin)可以被“捆绑”成尺寸更大的肌动蛋白束( β-actin)以增强细胞刚度,该过程 [ 依赖钙离子调节的聚合作用 [32-33] 。细胞内钙离子浓度降低促进 β-actin解聚为F-actin,导致细胞刚度降低,反之则细胞刚度增加 [33] 。推测衰老细胞内钙离子浓度增加可能会促进F-actin聚合成 β-actin,最终导致细胞刚度增加。以上研究表明,细胞刚度与actin关系密切。F-actin通过细胞核膜Nesprin蛋白与核纤层蛋白(Lamin)相连,Lamin A/C通过控制内核膜蛋白Emerin的定位影响MSCs的干性。Lee等 [19] 研究表明,较小刚度的MSCs具有多系分化潜能,较大刚度的MSCs只有单系或双系分化潜能,然而细胞刚度影响MSCs分化的相关机制尚不清楚。actin与细胞刚度关系密切,这或许能够为细胞刚度影响细胞分化能力的相关机制研究提供一些研究思路。而细胞刚度对MSCs成骨、成脂肪以及成软骨的具体影响仍然是不明确的,还需要大量的体内外研究进行证实。
细胞维持合适的核质比对于细胞功能有着重要的作用,核质比异常增大或者减小会降低核质运输的速率和RNA加工处理的效率 [34] 。通过荧光染色和共聚焦显微镜二维测量贴壁细胞细胞核与细胞质的面积比( S n ∶ S c )是目前测量核质比的常用方法。目前关于核质比与干细胞分化之间的关系尚不明确。研究表明在衰老过程中干细胞的核质比也会发生变化。衰老MSCs体积随着衰老程度增加而增大,而Wang等 [35] 研究表明,大体积小鼠MSCs比小体积小鼠MSCs核质比更小,提示衰老过程中MSCs核质比可能会发生下降。Ullmann等 [36] 研究发现,胚胎干细胞(embryonic stem cells)在分化增殖过程中细胞核质比发生下降。Rodrigues等 [17] 研究女性经血来源的MSCs,提取的细胞仅仅在开始几天具有较高的核质比,随着培养天数的增多,细胞核质比下降。上述研究提示,在衰老状态下细胞的核质比下降是一种较为普遍的现象。
衰老MSCs核质比下降的原因目前还不清楚,推测原因可能与细胞核体积下降或细胞体积增加有关。研究表明,衰老细胞体积的增加伴随着细胞核生长停滞 [37] 。衰老细胞的染色质特征是构成性异染色质域的展开,其特征主要是染色体周围卫星序列的扩张,染色质结构的这些变化与核膜的破坏有关,核层的丧失可导致衰老细胞向细胞质中释放出细胞染色质片段(cell chromatin fragments,CCFs)使得细胞核丧失内容物,这也意味着细胞核体积出现缩小 [37] 。因此,本文推测衰老细胞核质比变化的原因一方面是体积增大,另一方面是由于细胞核固缩,出现核质比减小。细胞核向细胞质释放CCFs这一细胞生物学过程与核纤层蛋白lamin密切相关,特别是lamin表达减少使得核膜完整性遭到破坏 [39] 。lamin可能通过控制细胞核CCFs的释放来影响细胞核的体积。Rogerson等 [40] 研究发现,lamin表达减少,细胞核体积会明显下降;相应地,如果抑制lamin磷酸化,细胞核的体积会增加。而lamin与干细胞命运的密切相关,故在探究核质比与MSCs分化的关系时,这为相关机制研究提供了一种新思路。
干细胞的物理异质性变化最近被广泛讨论,相关研究也证实细胞体积和刚度等会显著影响干细胞命运,尤其是在成骨和成软骨分化方面。但是,研究物理异质性仍然存在如下的一些困难:① 各种物理异质性之间的联系尚不清楚。有报道称细胞体积和细胞硬度之间有一定联系,甚至有线性关系,为物理参数的体外实验验证带来了一定的困难。② 尽管近年来衰老干细胞的物理异质性变化的研究已展开,但仍然缺乏足够的证据。这些研究大多是在探讨衰老细胞的其他问题时发现细胞物理性变化,不同研究报道甚至得到相反的结论。③ 由于细胞的物理参数在贴壁和悬浮状态下完全不同,细胞在衰老状态下形态也会发生较大的改变,使得物理参数的测量困难重重,目前仍然缺乏以衰老干细胞物理特征为主题的研究。但近些年迅速发展的细胞微流控芯片技术和AFM技术为研究MSCs物理特征带来希望。而且,衰老干细胞物理异质性的变化与细胞骨架、细胞核成分以及细胞微环境等有着密切的关系,这也为研究干细胞衰老的调控路径和机制提供了新方向。
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