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ω-3多不饱和脂肪酸对树突状细胞生物物理学特性及迁移能力的影响
王欢欢 b , 曾柱 ,b , 胡祖权 b , 宋萍萍 b

《医用生物力学》 2022年 38卷 第3期 008
中图分类号:R 318.01
全文 图表 参考文献 作者 出版信息
摘要
关键词
1 材料与方法
1.1 实验材料、试剂及仪器
1.2 小鼠骨髓来源单核细胞分离
1.3 DCs的诱导获取
1.4 DCs鉴定
1.5 EPA、DHA处理DCs
1.6 细胞活力检测
1.7 细胞凋亡检测
1.8 生物物理学特性检
1.9 细胞骨架F-actin检测
1.10 迁移能力检测
1.11 统计学分析
2 结果
2.1 不同成熟状态下,DCs形态学及CD11c阳性率表达
2.2 ω-3 PUFAs对DCs细胞活力的影响
2.3 ω-3 PUFAs对DCs凋亡的影响
2.4 ω-3 PUFAs对DCs生物物理特性的影响
2.5 ω-3 PUFAs对DCs细胞骨架的影响
2.6 ω-3 PUFAs对DCs迁移能力的影响
3 讨论
4 结论

摘要

目的 从生物物理学与免疫学交叉角度,分析二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)对鼠源树突状细胞(dendritic cells, DCs)生物物理学特性、细胞骨架及迁移能力的影响,探讨ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3 polyunsaturated fatty acids, ω-3 PUFAs)对DCs免疫功能的影响及其潜在作用机制。方法 分离C57BL/6J小鼠骨髓来源单核细胞,经20 ng/mL重组鼠集落刺激因子(recombinant mouse granulocyte macrophage colony stimulating factor, rmGM-CSF)和10 ng/mL重组鼠白介素-4(recombinant mouse interleukin-4, rmIL-4)诱导分化为未成熟树突状细胞(immature dendritic cells, imDCs),第6天加入100 ng/mL脂多糖诱导为成熟树突状细胞(mature dendritic cells, mDCs),进一步对imDCs及mDCs进行形态学观察及CD11c阳性率分析;通过细胞增殖检测试剂盒(cell counting kit-8, CCK-8)及流式细胞仪检测不同浓度EPA和DHA(浓度均为0~60 μmol/L)作用下DCs细胞活力及凋亡情况;在确定最佳作用浓度后分别通过荧光偏振法、细胞电泳法及浓度梯度法检测分析DCs的膜流动性、电泳迁移率(electrophoretic mobility, EPM)及渗透脆性变化,并用免疫荧光法检测其细胞骨架纤维状肌动蛋白(filamentous actin, F-actin)表达,最后利用Transwell系统检测DCs迁移能力。结果 imDCs及mDCs的CD11c阳性率均在80%左右;不同浓度EPA和DHA均呈剂量依赖性降低DCs细胞活力,但并没有诱导其凋亡。在50 μmol/LEPA和DHA作用下,DCs生物物理学特性均发生改变,其中渗透脆性和EPM明显下降,膜流动性明显增大。DCs细胞骨架F-actin含量表达均明显上升,迁移率显著下降。结论 ω-3 PUFAs可能会通过改变DCs细胞骨架结构及生物物理学特性,抑制细胞迁移能力,进而影响其免疫功能。

关键词: ω-3多不饱和脂肪酸 树突状细胞 生物物理学特性 细胞迁移 细胞骨架

ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3 polyunsaturated fatty acids, ω-3 PUFAs)作为人体必需脂肪酸之一,主要源于海洋微藻及深海鱼;其中二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)是其两种活性形式。ω-3 PUFAs具有改善移植器官功能、延长存活时间及减少排斥反应等功能,在防治自身性免疫疾病和移植物排斥反应方面发挥着重要作用。目前市场上大多免疫抑制剂缺少选择性及特异性,会引起机体不良反应,故寻找新型免疫抑制剂极其必要 。研究发现,ω-3 PUFAs可抑制鼠源T细胞(t-lymphocytes, T cells)增殖,影响其迁移能力及趋化因子受体表达,导致调节性T细胞类型的T细胞功能下降 。通过体外刺激或膳食补充,ω-3 PUFAs可整合到免疫细胞膜上,改变脂肪酸的组成,从而影响其免疫功能的发挥,如吞噬能力和抗原提呈能力 。但目前ω-3 PUFAs对免疫细胞的具体作用机制尚不清楚。
DCs是目前已知功能最强大的专职抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APC),从其发育状态来看,可分为未成熟树突状细胞(immature dendritic cells, imDCs)和成熟树突状细胞(mature dendritic cells, mDCs)。DCs表面有很多树枝状的突起,imDCs的突起短而稀疏,而mDCs的突起长且密集。外周组织中的imDCs在捕获抗原后,逐渐分化为mDCs并向次级淋巴结迁移,与原始T细胞相互作用以启动免疫反应。在此过程中,共刺激分子和趋化因子受体表达增加,DCs抗原提呈能力及迁移能力增强 ;同时,DCs的渗透脆性、电泳迁移率(electrophoretic mobility, EPM)及膜流动性等生物物理学特性发生改变,影响其免疫功能的发挥 。研究发现,ω-3 PUFAs可降低人源和鼠源DCs细胞因子和共刺激分子的表达,抑制T细胞活化,最终影响免疫功能发挥 。喂食小鼠ω-3 PUFA后,其鼠源T细胞增殖受到明显抑制
细胞骨架重构在细胞运动和功能发挥着重要作用 。细胞骨架是一种高度动态的结构体系,主要包括微丝、微管和中间丝;微丝由肌动蛋白单体组成,又称纤维状肌动蛋白(filamentous actin, F-actin)。当F-actin重塑时,能在多种肌动蛋白结合蛋白(actin binding protein, ABP)参与下持续进行组装和去组装,以满足不同分化阶段、细胞周期时相、运动状态及微环境中细胞功能改变的需要 。研究发现,当DCs与T细胞接触时,F-actin聚合使细胞形态及T细胞活化受到影响,最终影响免疫应答 [10,12]
鉴于细胞的生物物理性质与其功能密切相关,而细胞骨架重塑是细胞运动的基础,本文从生物物理学与免疫学的交叉角度,以鼠源imDCs及mDCs为研究对象,分析ω-3 PUFAs作用下DCs生物物理学特性、细胞骨架F-actin及迁移能力的变化。研究结果将为ω-3 PUFAs对DCs免疫功能的影响机制提供理论支持,也为器官移植领域中免疫抑制剂使用或替代提供可能。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂及仪器

1 . 1 . 1 实验动物 SPF级6~10周C57BL/6J小鼠购自贵州医科大学动物实验中心(有合格证),饲养于贵州医科大学生物与医学工程重点实验室。
1 . 1 . 2 主要试剂 脂多糖、红细胞裂解液、CCK-8试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;RPIM1640培养基购自美国Gibico公司;rmGM-CSF、rmIL-4购自美国Biolegend公司;胎牛血清购自美国SERANA公司;TMA-DPH试剂盒购自武汉艾美捷科技有限公司;Annexin V-FITC试剂盒购自上海爱必信科技有限公司;罗丹明标记的鬼笔环肽购自美国Thermo-Fisher Scientific公司;EPA、DHA购自上海源叶生物科技有限公司。
1 . 1 . 3 主要仪器 流式细胞仪购自美国BD公司;Cytation 5细胞成像多功能检测系统购自美国Bio Tek公司;激光共聚焦显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 小鼠骨髓来源单核细胞分离

选取8~10周C57BL/6J小鼠,处死后无菌环境分离股骨及胫骨,75%酒精及PBS洗涤后吹打出骨髓混匀,70 μm细胞筛过滤后使用红细胞裂解液室温裂解;后用含15%血清的1640培养基终止裂解,PBS洗涤即获得骨髓细胞。

1.3 DCs的诱导获取

以2×10 6 个/mL细胞重悬于1640培养基(含15%血清、1%青霉素-链霉素和0.1%β-巯基乙醇),使用20 ng/mL rmGM-CSF和10 ng/mL rmIL-4诱导,于5%CO 2 、37 ℃培养箱培养,隔日半换液,第6 d收集悬浮细胞即得imDCs;imDCs中加100 ng/mL脂多糖继续培养24 h即获得mDCs。

1.4 DCs鉴定

使用Cytation 5于200×倍镜下观察DCs形态,后调整细胞数为1×10 6 个/mL,PBS洗涤后4%多聚甲醛固定,使用1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)及0.2 mg/mL CD11c-APC荧光标记抗体混匀孵育,结束后PBS洗涤并重悬。流式细胞仪检测后FlowJo软件分析。

1.5 EPA、DHA处理DCs

调整细胞数为1×10 6 个/mL,设置0~60 μmol/L浓度梯度处理DCs,于5%CO 2 、37 ℃培养箱培养24、48 h;其中EPA处理组和DHA处理组(EPA及DHA皆使用50%乙醇配制)为实验组,50%乙醇组为对照组。确认最佳浓度后按上述步骤进行分组及处理。

1.6 细胞活力检测

调整细胞数为1×10 6 个/ mL,96孔板中接种细胞悬液,CCK-8法及酶标仪检测 OD 450 nm 值。细胞存活率根据下式计算:
细胞活力

1.7 细胞凋亡检测

调整细胞数为2×10 6 个/mL,预冷PBS洗涤后用1×binding buffer重悬,使用AnnexinV-FITC荧光抗体室温避光孵育;上机前补加3,8-二氨基-5-[3-(二乙基家氨基)丙基]-6-苯基啡啶二碘(PI)染液及1×binding buffer。流式细胞仪检测后FlowJo软件分析。

1.8 生物物理学特性检

1 . 8 . 1 渗透脆性 配制不同渗透压的渗透液备用,调整细胞数为1×10 6 个/mL。96孔板每孔接种不同渗透液处理细胞30 min,后通过CCK-8法及酶标仪检测 OD 450 nm 值。未破损细胞百分比根据下式计算:
细胞存活率
1 . 8 . 2 EPM 调整细胞数为1×10 5 个/mL,PBS洗涤后10%蔗糖溶液重悬,将细胞悬液加载到细胞电泳小室内。记录细胞电泳的距离、时间及加载电压。EPM的计算公式如下:
式中: S 为电泳距离, t 为电泳时间, V 为加载电压。可见EPM与细胞膜表面负电荷数量成正比。
1 . 8 . 3 膜流动性 调整细胞数为2×10 6 个/mL,PBS洗涤后培养基重悬,后用20 μmol/L 1,6-二苯基 1,3,5-己三烯(DPH)避光孵育,结束后PBS洗涤细胞并重悬,荧光光谱仪检测不同偏振度下的荧光偏振值( P )。荧光光谱仪参数设置如下:激发波长为355 nm、发射波长为430 nm,夹缝宽度为10 nm,激发电压为400 V,时间扫描为10 s。荧光偏振值的公式计算如下:
可见 P 与细胞膜脂双层分子的流动性成反比。

1.9 细胞骨架F-actin检测

调整细胞数为2×10 5 个/mL,4%多聚甲醛固定,PBS洗涤后0.1% Tritonx-100渗透,室温下用1% BSA封闭;避光用罗丹明标记的鬼笔环肽于4 ℃避光孵育2 h,后PBS洗涤,使用 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)溶液及抗荧光猝灭剂后进行封片。激光共聚焦显微镜488 nm处扫描拍照,Image J图像分析系统分析罗丹明荧光的表达,其中平均荧光强度代表细胞F-actin含量。

1.10 迁移能力检测

调整细胞数为5×10 5 个/mL,使用8 μm Transwell系统,下室接种原培养基,上室接种细胞悬液,于5%CO 2 、37 ℃培养箱继续培养,24 h后收集上下室细胞。CCK-8法及酶标仪检测 OD 450 nm 值,迁移速率根据下式计算:
细胞存活率

1.11 统计学分析

采用SAS软件和GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析统计绘图,每个实验至少重复3次,两组间采用 t 检验, P <0.05为差异具有统计学显著性, P <0.01为差异具有高度显著性。

2 结果

2.1 不同成熟状态下,DCs形态学及CD11c阳性率表达

通过Cytation 5观察imDCs及mDCs细胞形态。DCs均呈集落状生长,其中imDCs表面有不规则突起,而mDCs表面有不规则的、长度较长的突起。通过流式细胞法检测imDCs及mDCs中CD11c的表达,其CD11c阳性率均为80%左右(见 图1 )。
图1 不同成熟状态下DCs形态学及CD11c阳性率表达

2.2 ω-3 PUFAs对DCs细胞活力的影响

通过CCK-8法及酶标仪,分别检测EPA和DHA作用下DCs细胞活力的变化。EPA和DHA (浓度均为0~60 μmol/L)作用下,与对照组相比,在0~20 μmol/L 浓度下EPA和DHA并不影响DCs细胞活力,而在40~60 μmol/L浓度下EPA和DHA皆呈剂量依赖性降低DCs细胞活力(见 图2 )。
图2 不同浓度EPA和DHA作用下DCs细胞活力的变化

2.3 ω-3 PUFAs对DCs凋亡的影响

通过AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒检测及流式细胞法,分别检测EPA和DHA作用下DCs的凋亡情况。其中,横轴和纵轴分别为AnnexinV-FITC通道和PI通道,Q1为坏死细胞群,Q2和 Q3为凋亡细胞群,Q4为活细胞群。在EPA和DHA(浓度均为0~60 μmol/L)作用下,imDCs和mDCs均未发生凋亡(见 图3 )。
图3 不同浓度EPA和DHA作用下DCs凋亡情况比较

2.4 ω-3 PUFAs对DCs生物物理特性的影响

通过不同渗透压的渗透液、10%蔗糖处理及TMA-DPH试剂盒,分别检测EPA和DHA作用下DCs渗透脆性、EPM及膜流动性的变化。EPA和DHA(浓度均为50 μmol/L)作用下,与渗透压295 mOsm/kg(等渗组)及对照组相比,在渗透压175、55 mOsm/kg时,imDCs及mDCs的渗透脆性明显减小,同时EPM明显降低,而膜流动性明显增大(见 图4 )。
图4 50 μmol/LEPA和DHA作用下DCs生物物理学特性比较

2.5 ω-3 PUFAs对DCs细胞骨架的影响

通过激光共聚焦显微镜及Image J图像分析系统,分别检测EPA和DHA作用下DCs罗丹明荧光的表达。在EPA和DHA(浓度均为50 μmol/L)作用下,与对照组相比,imDCs及mDCs胞体面积明显增大,同时F-actin表达明显增加;其中EPA处理组胞体面积显著性大于DHA处理组(见 图5 )。
图5 50 μmol/L EPA和DHA作用下DCs细胞骨架结构比较

2.6 ω-3 PUFAs对DCs迁移能力的影响

通过Transwell系统及CCK-8法,分别检测EPA和DHA作用下DCs迁移能力的变化。在EPA和DHA(浓度均为50 μmol/L)作用下,与对照组相比,imDCs迁移率及mDCs迁移率显著下降;且EPA处理组迁移率皆明显低于DHA组(见 图6 )。
图6 50 μmol/LEPA和DHA作用下DCs迁移能力比较

3 讨论

ω-3 PUFAs作为人体必需脂肪酸,可影响细胞膜结构及免疫细胞的活化。研究发现,ω-3 PUFAs可抑制巨噬细胞的吞噬能力及细胞因子分泌,显著改变其微小核糖核酸表达谱 。而DCs是目前已知功能最强大的APC,处于启动、调控及维持免疫应答的中心环节 。细胞生物物理学特性的改变会影响其免疫功能发挥,而细胞骨架F-actin活化则是其运动的基础 。本实验中,在50 μmol/L ω-3 PUFAs作用下,鼠源imDCs及mDCs的生物物理学特性、细胞骨架F-actin及迁移能力均发生明显变化。
形态学上,DCs 表面的典型特征是不规则树突样突起,但无特异性标记分子。因此,小鼠骨髓来源DCs可通过形态学观察及CD11c阳性率表达等特征进行组合鉴定 [13-14] 。本实验中DCs表面均有不规则突起,mDCs细胞表面突起比imDCs多且长。两者的CD11c阳性率均在80%左右的。Liu等 研究发现,小鼠骨髓来源DCs的CD11c阳性率可达到70%~85%左右,该结果与本实验结是一致。
特定条件下,ω-3 PUFAs可能通过改变细胞的生物物理特性,进而诱导其凋亡。研究发现,在250 μmol/L ω-3 PUFAs作用下,人前脂肪细胞生长被抑制甚至发生凋亡 ;而60 μmol/L ω-3 PUFAs可抑制人早幼粒白血病细胞生长并诱导其凋亡 。也有研究表明,鱼藤酮可促进神经祖细胞凋亡,原因可能是其膜流动性及黏附力等生物物理特性减弱 。本实验表明,EPA和DHA均呈浓度依赖性降低DCs活力,同时生物物理学特性弱化,但没有诱导其凋亡。Hu等 研究发现,血管内皮生长因子可影响人源mDCs生物物理特性,但并没有诱导其发生凋亡。由此看出,不同机体环境下细胞可能对EPA和DHA的应答机制不同,而不同浓度EPA和DHA作用下细胞的反应状态也有很大差异。
细胞的生物物理学特性主要体现在渗透脆性、EPM及膜流动性等方面,它们与细胞结构和功能密切相关。渗透脆性是指细胞对不同渗透压抵抗的能力,正常细胞在渗透压较低的溶液中有抗低渗性;EPM是指恒定电场下细胞的运动速率,反映细胞膜表面电荷密度的分布 ;细胞膜流动性是指细胞膜或合成脂膜的脂质双层的黏度,这直接影响细胞功能 。研究发现,伏马菌素B1可降低人脐静脉内皮细胞的渗透脆性、EPM和膜流动性,从而使其迁移能力受到抑制 。本实验结果表明,ω-3 PUFAs使DCs渗透脆性明显降低,EPM明显下降,而膜流动性明显增大,同时迁移能力显著受到抑制。另有研究发现,转化生长因子-β1会使人源mDCs渗透脆性及EPM降低,而膜流动性增大,最终导致mDCs迁移能力受到抑制 。由此看出,ω-3 PUFAs可能通过改变DCs生物物理学特性,影响其迁移能力,最终影响免疫功能发挥。
细胞骨架F-actin在细胞形态、细胞黏附及细胞运动等过程发挥极其重要作用。研究发现,DCs细胞骨架F-actin的聚合与多种ABP相关,这会影响细胞的抗原捕获、迁移效率及免疫突触形成 。而DCs迁移受到两个肌动蛋白池调控:小R蛋白家族A-哺乳动物膈肌相关成蛋白1及细胞分裂控制蛋白42同源物-肌动蛋白相关蛋白2/3 。本实验表明,50 μmol/L ω-3 PUFAs作用下DCs的F-actin表达明显上调,同时其迁移能力显著下降。有研究发现,胞外酸中毒可降低鼠源imDCs的F-actin表达,最终导致其迁移能力受到抑制 。由此看出,ω-3 PUFAs可能通过调控F-actin聚合,影响其迁移能力,进而影响DCs的免疫功能。

4 结论

特定浓度下ω-3 PUFAs可能通过改变DCs的生物物理特性及细胞骨架结构,抑制其迁移能力,从而影响DCs的免疫功能。本文研究结果为深入理解ω-3 PUFAs对DCs免疫功能的影响机制提供了基础理论支持。
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